By browsing our site you agree to our use of cookies. You will only see this message once.

Find out more

Ewald A.W.J. Dumont - Molecular Imaging Of Programmed Cel Death In The Heart

Terug
 
SUMMARY

Myocardial infarction is a major killer in the Western world and continuous to increase in the third world. In the USA alone, 1.5 million people suffer from a myocardial infarc­tion each year. During myocardial infarction, cardiac cells in the ischemic area undergo cell death. Since the heart has minimal regenerative capacity, many patients suffering from AMI develop heart failure, leading to high morbidity and mortality. In the last decade it has become clear that many cells during infarction die from apoptosis, so-called programmed cell death. In contrast to necrosis, or accidental cell death, apoptosis is characterized by tightly orchestrated activation of apoptosis inducing proteins and/or enzymes within the cell, which results in the execution of the cell.

The extensive knowledge about the signaling events during apoptosis, generated in the last decade, provides us with potential targets for intervention. However, application of this knowledge into clinical therapeutic modalities in patients suffering from acute myocar­dial infarction is hampered by lack of insight into the regulation and kinetics of programmed cell death in the heart during infarction. First of all, it is unknown which proportion of cardiac cells die from apoptotic or necrotic cell death. This question is critical, since this will determine the potential benefit of anti-apoptotic treatment. An important aspect in this discussion is that cells undergoing programmed cell death may not always end up as a typical apoptotic cell, but may also exhibit necrotic characteris­tics. Second, essential information with respect to the kinetics of cell death is still lacking. This information is needed to define the duration of efficacy of cell death inhib­iting therapy. A critical element in the assessment of the duration of efficacy is the defi­nition of the 'point of no return' and the kinetics of activation of the cell death program during cardiac ischemia. Finally, before apoptosis inhibiting compounds can be used in patients, we need to know if, and to what extent, apoptosis occurs in human myocardial infarction.

When this study was started, the in vivo assessment of apoptosis was mainly done with DNA laddering and/or the terminal dUTP nick end-labelling assay (TUNEL). These methods are hampered by the fact that tissue samples from the organ of interest are needed to measure apoptosis. As a consequence, the spatial resolution of these methods is limited. In addition, no in vivo imaging can be done using DNA laddering and/or the TUNEL assay. The aim of our research project was to develop a method to visualize programmed cell death with high spatial resolution, which could also be developed as an in vivo imaging tool. To achieve this goal we started to use labelled Annexin-A5 for the detection of cell death in an ischemia and reperfusion model in the mouse. Annexin-A5 is a protein with high affinity for phosphatidyl serine (PS), which is externalized by cells undergoing apoptosis. In the first project we show that biotinylated Annexin-A5 is an easy marker to assess programmed cell death in the heart subjected to ischemia and reperfusion in vivo. Further, in this study we verified that Annexin-A5 binding to cardiomyocytes correlated with other apoptosis measuring techniques, such as DNA laddering and TUNEL. In addition these data showed that Annexin-A5 can be used to evaluate anti-apoptotic drugs in ischemia mediated injury of the heart in vivo.

In a second study, we developed an imaging model system, which allowed for the first time to detect binding of fluorescent labeled Annexin-A5 at the level of the single cell in the beating heart of the living mouse. These observations showed that Annexin-A5 binds to cardiomyocytes in the area at risk within minutes after the onset of reperfusion. These data indicate that the duration of efficacy of cell death inhibiting drugs may have a narrow time frame. In a third study we attempted to define whether PS externalisation in the heart occurs before or after the 'point of no return' in the cell death program. This study showed that Annexin-A5 binds to cardiomyocytes in the area at risk after brief episodes of ischemia, but that these cells do not undergo cell death, Intriguingly, the binding of Annexin-A5 was associated with activation of one of the key executioners of the cell death program, caspase-3. Together, these results demonstrate that cardiomyocytes can be resuscitated from initial activation of the cell death program, if reperfusion is restored rapidly enough. These data provide a novel concept on how the cell death process is regulated in mammalian cells. In the final part of the thesis we attempted to visualize programmed cell death in patients suffering from acute myocar­dial infarction. Using technetium labeled Annexin-A5 and nuclear imaging, these data show, for the first time, that programmed cell death can be visualized in the ischemic area of the heart in patients with acute myocardial infarction. Furthermore, these data suggest that a form of cell death occurs in human myocardial ischemia that should be amenable to anti-apoptotic intervention. In a final study we observed that enhanced uptake of Annexin-A5 can possibly be used to diagnose essential diagnostic information of intra-cardiac tumors. A high level of apoptosis, and thus uptake of Annexin-A5, is seen in malignant tumors. Therefore, high uptake of Annexin-A5 in an unknown intra-cardiac mass may provide essential diagnostic information as to the pathology of the tumor, which may have a direct effect on the management of the patient.

Together, the studies presented in this thesis provide new insights in the kinetics and extent of programmed cell death in the heart subjected to ischemia and reperfusion in vivo. This may help to guide anti-apoptotic strategies in patients with acute myocardial infarction. In addition, the thesis describes for the first time recovery from cell death in the mammal heart in vivo. Regulation of recovery from programmed cell death may help to develop novel strategies to prevent loss of cells during ischemia. Finally, the visualization of programmed cell death in vivo in patients with acute myocardial infarc­tion, using technetium labeled Annexin-A5, provides a major contribution to the field of molecular imaging of apoptosis. This technology is close to be used in clinical practice.

SAMENVATTING

Het hartinfarct is de belangrijkste doodsoorzaak in de westerse wereld. Alleen al in de Verenigde Staten krijgen 1,5 miljoen mensen per jaar een hartinfarct. Bij een hartinfarct sterven hartspiercellen in het aangedane, ischemische gebied. Omdat het hart slechts een geringe regeneratieve capaciteit heeft, ontwikkelen veel patiënten na een acuut hartinfarct harttalen, wat leidt tot een hoge morbiditeit en mortaliteit. In de laatste 10 jaar is het duidelijk geworden dat tijdens het hartinfarct veel cellen in het hart dood gaan door apoptose, ook wel geprogrammeerde celdood genoemd. In tegenstelling tot necrose, ofwel accidentele celdood, wordt apoptose gekarakteriseerd door een nauw gereguleerde en geprogrammeerde activatie van apoptose-inducerende eiwitten en/of enzymen binnen de cel, wat uiteindelijk resulteert in het afsterven van de cel.

De uitgebreide kennis opgedaan in de laatste 10 jaar over signalering gedurende apoptose biedt echter mogelijkheden om in te grijpen in dit proces, maar het vertalen van deze kennis in klinische en therapeutische toepassing bij patiënten die een acuut hartinfarct hebben, wordt bemoeilijkt door het ontbreken van inzicht in de regulatie en de kinetiek van geprogrammeerde celdood ten tijde van het hartinfarct. Ten eerste is het niet bekend welk deel van de hartspiercellen dood gaan via apoptose of necrose. Deze vraag is van groot belang, aangezien dit het potentieel voordeel bepaalt van anti-apoptotische behandeling bij hartziekten. Een belangrijk punt hierbij is dat hartspiercellen die geprogrammeerde celdood ondergaan niet altijd eindigen als een typisch apoptotische cel, maar dat deze ook necrotische eigenschappen kunnen vertonen. Ten tweede is de snelheid van het optreden van celdood, de kinetiek, niet bekend. Deze informatie is nodig om de werkzame periode van celdood-remmende therapie te kunnen vaststellen. Een kritisch element in de bepaling van deze werkzame periode is de definitie van het punt van onomkeerbare schade, ofwel het 'point of no return' en de kinetiek van activatie van het celdoodprogramma gedurende cordiale ischemie.

Tenslotte, voordat apoptose-inhiberende stoffen gebruikt kunnen worden in patiënten, is het nodig te weten welk aandeel apoptose heeft gedurende het hartinfarct bij de mens.

Bij het starten van dit onderzoek, werd apoptose voornamelijk bepaald met "DNA laddering" en/of de "terminal dUTP nick end-labelling" methode (TUNEL). De toepasbaarheid van deze methoden is beperkt, omdat weefselbiopten uit het betreffende orgaan nodig zijn om apoptose aan te tonen. Als gevolg zijn het tijdsverloop en de uitgebreidheid ervan niet goed te bepalen. Een additioneel probleem is dat er géén in vivo beeldvorming kan plaatsvinden met DNA laddering en/of TUNEL.

Een van de doelen van dit onderzoek was dan ook het ontwikkelen van een methode om geprogrammeerde celdood zichtbaar te maken in vivo met een hoge temporele en spatiële resolutie. Om dit doel te bereiken zijn we gestart met het gebruik van gelabeld Annexine-A5 voor de detectie van celdood in een model van ischemie en reperfusie van het hart in de muis. Annexine-A5 is een eiwit met een hoge affiniteit voor fosfatidylserine (PS), een fosfolipide dat op de buitenzijde van de celmembraan tot expressie komt in cellen die apoptotische celdood ondergaan.

In het eerste project hebben we aangetoond dat gebiotinyleerd Annexine-A5 een goede marker is voor geprogrammeerde celdood in het hart dat blootgesteld is aan ischemie en reperfusie in vivo. Daarnaast correleert Annexine-A5 binding met andere apoptose meettechnieken zoals DNA laddering en TUNEL, waarbij Annexine-A5 echter reeds in een eerder stadium aan de apoptotische cel bindt. Hieruit blijkt dat Annexine-A5 gebruikt kan worden om anti-apoptotische therapieën bij ischemisch gemedieerde schade van het hart in vivo te testen.

In de tweede studie hebben we een nieuw beeldvormingssysteem ontwikkeld, waarmee de binding van fluorescent gelabeld Annexine-A5 voor de eerste keer op het niveau van de enkele cel in het kloppende muizenhart van de levende muis is waargenomen. Hier wordt aangetoond dat Annexine-A5 binnen enkele minuten na het begin van de reperfusiefase bindt aan harspiercellen in het aangedane gebied. Verder laat deze studie zien dat apoptose remmende therapie effectief is ondanks het feit dat de werkzame periode van celdood-inhiberende medicijnen in een klein tijdsinterval moet plaatsvinden.

In een derde studie hebben we getracht te bepalen of PS externalisatie in het hart gebeurt vóór of na het 'point of no return' in het celdoodprogramma. Deze studie liet zien dat Annexine-A5 tijdelijk bindt aan cardiomyocyten in het aangedane gebied na een korte periode van ischemie, maar dat deze cellen niet dood gaan. Opmerkelijk is dat de binding van Annexine-A5 geassocieerd is met de activatie van één van de belangrijkste apoptose-inducerende eiwitten van het celdoodprogramma, namelijk caspase-3. Deze gegevens suggereren dat harspiercellen zich kunnen herstellen (geresusciteerd kunnen worden) van celdood, indien de reperfusie snel genoeg wordt hersteld. Deze gegevens vormen de basis voor een nieuw concept (escapoptose) op welke wijze het celdoodprogramma gereguleerd is in zoogdiercellen. In hoofdstuk 7 van dit proefschrift hebben we gepoogd om celdood zichtbaar te maken in patiënten na een acuut hartinfarct. Met Technetium gelabeld Annexine-A5 en nucleaire beeldvorming konden we voor de allereerste keer laten zien dat geprogrammeerde celdood zichtbaar gemaakt kan worden in het ischemische gebied in het hart van patiënten met een acuut hartinfarct. Deze bevindingen suggereren dat er een vorm van celdood optreedt in hartspiercellen die toegankelijk is voor een anti-apoptotische behandeling.

In de laatste studie hebben we gezien dat een verhoogde opname van Annexine-A5 mogelijk gebruikt kan worden om de pathologie te bestuderen van intra-cardiale tumoren. Veel apoptose, en dus veel Annexine-A5 opname, wordt onder andere gezien in kwaadaardige tumoren. Hoge opname van Annexine-A5 in een intra-cardiale tumor van onbekende maligniteitsgraad kan essentiële diagnostische informatie bieden over de pathologie van de tumor, hetgeen een direct effect heeft op de behandeling van de patiënt.

Samengenomen bieden de gepresenteerde studies in dit proefschrift nieuwe inzichten in de kinetiek en uitgebreidheid van geprogrammeerde celdood in het hart dat blootgesteld is aan ischemie en reperfusie in vivo. Daarnaast wordt in dit proefschrift voor de eerste keer beschreven, dat hartspiercellen in vivo kunnen herstellen van de initiatie van geprogrammeerde celdood. Kennis van de voorwaarden voor herstel kan ons helpen om nieuwe behandelingsstrategieën te ontwikkelen om celverlies gedurende cardiale ischemie te voorkomen. Het in vivo zichtbaar maken van geprogrammeerde celdood in patiënten met een acuut hartinfarct, gebruikmakend van Technetium gelabeld Annexine-A5, is een bijdrage tot moleculaire beeldvorming van apoptose. Een eerste toepassing van deze technologie staat nu dicht bij de introductie in de dagelijkse klinische praktijk.
Powered By: webCiters