By browsing our site you agree to our use of cookies. You will only see this message once.

Find out more

J.W.M. Vehof - Engineered Boone - Matrices, cells and bioactive melecules

Terug
 
Samenvatting, evaluatie van de doelstellingen, afsluitende opmerkingen en toekomstperspectief

Om de huidige klinische problemen die optreden bij de behandeling van grote botdefecten te overwinnen, worden momenteel zogenaamde tissue engineering technieken ontwikkeld met als doel het vervaardigen van bone graft substitutes (BGSs) of bottransplantaat-vervangers. Hierbij wordt gebruik gemaakt van (meestal synthetische) poreuze drager-materialen, waaraan botvormende cellen en/of groeifactoren worden toegevoegd. De onderzoeks-inspanningen hebben zich vooral toegespitst op het ontwikkelen van een ideaal dragermateriaal. Desondanks voldoet nog steeds geen van de nu beschikbare materialen aan alle gestelde klinische eisen. In dit verband stellen wij dan ook voor om het potentieel van titanium vezelgaas dragermateriaal te onderzoeken. Titanium vezelgaas is biocompatibel, gemakkelijk te gebruiken bij operaties en bezit een zekere stevigheid, waardoor het met name veel geschikter lijkt voor toepassing bij de regeneratie van botweefsel dan alle tot nu toe geteste materialen. Een ander voordeel is dat titanium vezelgaas kan worden voorzien van een dunne bioactieve calciumfosfaat (Ca-P) coating. Het onderwerp van alle in dit proefschrift beschreven experimenten is dan ook het mogelijke gebruik van titanium vezelgaas met of zonder dunne Ca-P coating als dragermateriaal ter vervaardiging van BGSs. In hoofdstuk 1 wordt een algemene inleiding gegeven over de huidige kennis op het gebied van botvorming en het gebruik van de diverse tissue engineering methoden. In de daarop volgende hoofdstukken worden de doelstellingen van dit proefschrift stapsgewijs uiteengezet. Elk hoofdstuk bevat een opzichzelfstaand onderzoek.


Doelstellingen


1. Wat is de in vitro osteogene expressie van ratten beenmergcellen aangebracht in poreus titanium vezelgaas? Wat is verder de invloed van celdichtheid en rhBMP-2-concentratie op deze osteogene expressie?

In hoofdstuk 2 worden een zogenaamde lage dichtheid (3.54x104 cellen/cm2 =10.000 cellen per vezelgaas) en hoge dichtheid (3.54x105 cellen/cm2 =100.000 cellen per vezelgaas) ratten beenmergcellen (RBM) aangebracht in titanium vezelgaas. Om de osteogene expressie te bepalen werden de cellen gedurende zestien dagen gekweekt, waarvan zeven dagen in aanwezigheid van diverse concentraties rhBMP-2 (0, 10, 100 en 1000 ng/ml). Scanning electronen microscopie (SEM) en energie dispersieve spectrometrie (EDS) liet zien dat aan de bovenkant van het vezelgaas een confluente cellaag aanwezig was met verder collageen vezels en een neerslag van zogenaamde gecalcificeerde globuli. Licht microscopie (LM) bevestigde het osteogene karakter van deze laag. SEM en calcium-bepalingen toonden aan dat het calcificatieproces van de cellen begon op dag acht. Verder bleek het DNA gehalte op die dag het hoogst te zijn. SEM, LM en calciumbepalingen lieten voorts een positief effect zien van het verhogen van de celdichtheid, de rhBMP-2 concentratie en de tijdsduur van de celkweek op de verkalking van de cellen in het vezelgaas. Het verhogen van de celdichtheid resulteerde tevens in een toename van het DNA-gehalte. Het variëren van de rhBMP-2 concentratie bleek geen effect op het DNA-gehalte te hebben. Ten slotte liet de XRD zien dat de gevormde matrix een neerslag bevatte van een stabiele calciumfosfaat fase. Hieruit concluderen we dat (1) titanium vezelgaas uitstekend de in vitro osteogene expressie van beenmerg cellen ondersteunt, (2) het verhogen van de celdichtheid een positief effect heeft op de in vitro osteogene expressie in titanium vezelgaas en (3) bij hoge celdichtheden rhBMP-2 concentraties van 100 ng/ml en 1000 ng/ml de calcificatie van de extracellulaire matrix stimuleren op een dosis afhankelijke wijze.

2. Kan titanium vezelgaas geladen met gekweekte osteogene cellen, aanleiding geven tot botvorming in een ectopische locatie en wat is hierbij de additionele invloed van de toepassing van een dunne Ca-P coating?

In hoofdstuk 3 is de osteogene activiteit van poreus titanium vezelgaas, eventueel voorzien van een dunne Ca-P coating en geladen met ratten beenmergcellen onderzocht. Bij dertig genetisch identieke ratten werd poreus titanium vezelgaas met en zonder Ca-P coating en al dan niet geladen met gekweekte RBM-cellen, subcutaan geïmplanteerd. De ratten werden twee, vier of acht weken na het implanteren van de titaniumimplantaten op-geofferd, waarna histologisch onderzoek plaats vond van deze implantaten. Tevens dient hierbij opgemerkt te worden dat in de acht weken-groep na twee, vier en zes weken im-plantatie fluorochrome merkers geïnjecteerd werden in de ratten. Het histologisch onderzoek liet zien dat op geen enkel implantatietijdstip in geen enkel poreus titanium vezelgaas zonder RBM-cellen botvorming had plaatsgevonden. In titanium vezelgaas geladen met RBM-cellen vond wel botvorming plaats. De botvorming begon op twee weken en was na vier weken verder toegenomen. Echter na acht weken werd geen botvorming meer gezien in het niet Ca-P gecoate vezelgaas, terwijl nog wel botvorming aanwezig was in het titanium vezelgaas met een Ca-P coating. Ook was in het vezelgaas met een Ca-P coating meer bot gevormd dan in het vezelgaas zonder Ca-P coating. Over het algemeen werd de botvorming gekenmerkt door het optreden van meerdere bolvormige lokalisaties in de poriën van het titanium vezelgaas. De neerslagvolgorde van de fluorochrome merkers liet zien dat het bot was gevormd op centrifugale wijze en dat de botvorming was begonnen in het midden van een porie. Gebaseerd op deze resultaten concludeerden wij dat de combinatie van titanium vezelgaas met gekweekte RBM-cellen aanleiding kan geven tot botvorming op een ectopische lokatie. Daarnaast worden de botvormende eigenschappen van het titanium dragermateriaal verder bevorderd door het aanbrengen van een dunne Ca-P coating. Niettemin dient benadrukt te worden dat de hoeveelheid bot zeer beperkt was met de in deze studie gebruikte methoden.

3. Wat is het effect van de celzaai-techniek in combinatie met doorkweken in situ op ectopische botvorming in titanium vezelgaasdragers?

In het onderzoek dat is beschreven in hoofdstuk 3 bleek de hoeveelheid nieuw bot zeer beperkt te zijn in titanium vezelgaas geladen met osteogene cellen. We veronderstelden dat dit was gerelateerd aan onze kweek- en celzaaitechniek, die bestond uit een zogenaamde druppellaadtechniek zonder doorkweken in vitro. Daarom werden in het experiment zoals beschreven in hoofdstuk 4 genetisch identieke osteogene cellen met behulp van een druppel- of een suspensiezaai-methode aangebracht in poreus titanium vezelgaas. Het vezelgaas was wederom al of niet van een Ca-P coating voorzien. Het titanium vezelgaas werd acht dagen in kweek gehouden na het aanbrengen van de beenmergcellen. Vervolgens werden de implantaten op dezelfde wijze en voor dezelfde implantatietijden, als beschreven in hoofdstuk 3, subcutaan aangebracht bij 39 genetisch identieke ratten. Wederom werden in de acht weken-groep fluorochrome merkers geïnjecteerd op twee, vier en zes weken. Histologisch onderzoek liet zien dat uitsluitend nieuw bot was gevormd in het titanium vezelgaas dat voorzien was van een Ca-P coating. De hoeveelheid gevormd bot varieerde van één of enkele bolvormige lokalisaties tot een hoeveelheid waarbij de porositeit voor een belangrijk deel werd gevuld. In het nieuw gevormde bot waren duidelijk osteocyten zicht-baar. Deze waren, ingebed in een gemineraliseerde matrix. In het titanium vezelgaas zonder Ca-P coating werd alleen een ruime hoeveelheid gemineraliseerde substantie waar-genomen. Deze substantie vertoonde geen enkel teken van botweefsel organisatie. De calciumbepaling liet zien dat de celzaai-techniek niet van invloed was op de uiteindelijke hoeveelheid botvorming. In titanium vezelgaas met een Ca-P coating liet de neerslag volgorde van de fluorochrome merkers zien dat de botvorming begonnen was op het titanium vezelgaas oppervlak. Derhalve kan geconcludeerd worden dat de combinatie van titanium vezelgaas met RBM-cellen ectopische botvorming kan genereren na doorkweken in vitro. Het effect van het doorkweken in vitro verschilde voor titanium vezelgaas met en zonder Ca-P coating: botvorming was alleen aanwezig in dragers met een Ca-P coating. De celzaaimethode had geen enkele invloed op de uiteindelijke hoeveelheid bot. Tenslotte bevestigden onze resultaten dat een dunne Ca-P coating een additioneel positief effect kan hebben op de botvormende eigenschappen van een dragermateriaal.

4. Kan titanium vezelgaas dat voorzien is van botvorming stimulerende eiwitten, zoge-naamde BMPs, botvorming induceren in een ectopische locatie en kan het osteo-inductieve effect van recombinant humane BMP synergistisch worden versterkt door bovine BMP?

In hoofdstuk 5 onderzochten wij de osteo-inductive eigenschappen van poreus titanium vezelgaas met of zonder dunne Ca-P coating en geladen met recombinant humane BMP-2 (rhBMP-2) of bovine BMP [S-300 BMP cocktail (S-300)]. Hiervoor werden 112 titanium vezelgaas dragers met een Ca-P coating en 112 zonder Ca-P coating, geladen met rhBMP-2 of rhBMP-2 + S-300. Deze implantaten werden vervolgens subcutaan aangebracht in 56 Wistar King ratten. De ratten werden na vijf, tien, twintig of veertig dagen opgeofferd, waarbij de titanium implantaten werden verwijderd. Histologisch onderzoek liet zien dat alle groeifactor en drager combinaties na 5 en 10 dagen respectievelijk ectopische kraakbeen- en botvorming hadden geïnduceerd. Na 20 dagen nam de botvorming toe. De botvorming werd gekenmerkt door de aanwezigheid van trabeculair bot en beenmergachtig weefsel. Na 40 dagen was het bot meer lamellair van opbouw en was er meer beenmergachtig weefsel aanwezig. Na 20 en 40 dagen implantatie werd er ook duidelijk meer bot gezien in titanium vezelgaas met een Ca-P coating dan in titanium vezelgaas zonder Ca-P coating. Eveneens was er meer bot aanwezig in het vezelgaas geladen met de combinatie rhBMP-2 + S-300 dan in vezelgaas met alleen rhBMP-2. Verder was in titanium vezelgaas met rhBMP-2 de botvorming hoofdzakelijk gelokaliseerd binnen in het vezelgaas terwijl in het titanium vezelgaas met rhBMP-2 + S-300 botvorming zowel binnenin als aan de buitenkant van het titanium plaats vond. De histologische resultaten werden bevestigd door de calciumbepaling en alkalisch fosfatase-activiteit meting. Hieruit concludeerden we dat (1) de combinatie van titanium vezelgaas met BMPs ectopische botvorming kan induceren, (2) deze botvorming gekenmerkt lijkt te zijn door “enchondrale ossificatie”, (3) een dunne Ca-P coating een positief effect heeft op de botinducerende eigenschappen van een dragermateriaal en (4) rhBMP-2 en S-300 hierbij synergistisch werken.

 5. Hoe verloopt het botvormingsproces onder invloed van BMP in verschillende drager-materialen?

In hoofdstuk 6 werden de osteo-inductieve eigenschappen van poreus titanium vezelgaas met een Ca-P coating (Ti-CaP), geïnactiveerde gedemineraliseerde bot matrix (IBM), glasvezel membraan (FGM) en poreuze hydroxyapatiet partikels (PPHAP) vergele-ken. Al deze materialen werden geladen met rhBMP-2 en vervolgens voor 3, 5, 7 of 9 dagen subcutaan geïmplanteerd bij ratten. Histologisch onderzoek liet zien dat zowel IBM als Ti-CaP ectopische kraakbeen- en botvorming induceerden na respectievelijk 5 en 7 dagen. In PPHAP werd bot- en kraakbeenvorming waargenomen na 7 dagen implantatie. Na 9 dagen was er in Ti-CaP, IBM en PPHAP zowel kraakbeen als trabeculair bot aanwezig. In FGM daarentegen was op dit tijdsstip alleen kraakbeen te zien. Hieruit concludeerden wij dat in een rattenmodel zowel Ti-CaP, IBM, FGM als PPHAP geladen met rhBMP-2 reeds na korte tijd ectopische botvorming kunnen induceren. De botvorming ging altijd gepaard met kraakbeenvorming. De hoeveelheid kraakbeen kan hierbij echter verschillen. Wij veronderstellen dat deze verschillen samenhangen met de mate waarin bloedvatingroei in het dragermateriaal kan plaatsvinden.

6. Wat is de botvormingondersteunende activiteit van recombinant humane Transforming Growth Factor beta-1 (rhTGF-β1) aangebracht in titanium vezelgaas, in een orthotopische locatie?

In hoofdstuk 7 evalueerden we de botvormingondersteunende eigenschappen van poreus titanium (Ti) vezelgaas al of niet voorzien van een Ca-P coating (Ti-CaP) en geladen met rhTGF-β1 (Ti-TGF-β1) in een schedeldakdefect bij konijnen. Negen Ti-CaP, negen Ti en negen Ti-TGF-β1 implantaten werden aangebracht in de schedels van achttien konijnen. Na acht weken werden de konijnen opgeofferd en werden de schedels met de implantaten verwijderd. Histologisch onderzoek liet zien dat in het vezelgaas met rhTGF-β1 bot was ge-vormd door de gehele porositeit van het implantaat tot aan de kern. In de implantaten zonder rhTGF-β1 vond slechts gedeeltelijke botingroei plaats. Het nieuw gevormde bot werd gekenmerkt door trabeculair bot met beenmergachtig weefsel. In de implantaten zonder rhTGF-β1 werd geen verschil in botingroei gevonden tussen implantaten met en zonder Ca-P coating. Alle histologische bevindingen werden bevestigd door beeldanalyse; 97% ingroei werd gezien in de met rhTGF-β1 geladen implantaten, terwijl de niet-geladen implantaten met of zonder Ca-P coating respectievelijk 57% en 54% ingroei lieten zien. Het totale botoppervlak in het vezelgaas (1,37 mm2) en de hoeveelheid bot als percentage van het totale vezelgaas oppervlak (36%) waren significant groter in de met rhTGF-β1 geladen implantaten vergeleken met de niet-geladen implantaten (0,57 mm2 en 26%). Er werden geen statistische verschillen gevonden tussen implantaten met of zonder Ca-P coating voor de bestudeerde parameters. Fluorochrome merkers lieten zien dat in de Ti en de Ti-CaP implantaten met name botgeleiding had plaatsgevonden vanuit de oorspronkelijke rand van het botdefect. In de Ti-TGF-β1 implantaten startte de botvorming in het midden van een porie en breidde zich vervolgens uit op centrifugale wijze. Op basis van deze bevindingen concluderen wij dat (1) de combinatie van titanium vezelgaas geladen met rhTGF-β1 orthotopische botvorming kan induceren, (2) titanium vezelgaas goede osteo-conductieve eigenschappen bezit, en (3) een dunne Ca-P coating, zoals in deze studie werd toegepast, de botgeleidende eigenschappen van het Ti-dragermateriaal niet verder stimuleert.

7. Wat is het osteo-inductief vermogen van poreus poly(propyleen fumaraat) (PPF) voorzien

van rhTGF-β1 in een orthotopische locatie en wat is tevens het effect van het aanbrengen van een fibronectinecoating op het poreuze PPF op de uiteindelijke botrespons?

In hoofdstuk 8 bestudeerden we de botvormingondersteunende eigenschappen van voorbehandelde PPF-dragers aangebracht in een schedeldakdefect bij konijnen. Het poreuze PPF-dragermateriaal werd op vier verschillende manieren voorbehandeld: (1) voorbevochtigd met alcohol en water (PPF-Pw), (2) radiofrequent gloeien (PPF-Gd), (3) aanbrengen van een fibronectine coating (PPF-Fn) en (4) aanbrengen van een rhTGF-β1 coating (PPF-TGF-β1). Bij negen konijnen werd één specimen van elk type drager in de schedel aange-bracht. Na acht weken werden de konijnen opgeofferd en werden de implantaten histo-logisch bewerkt. Licht microscopisch onderzoek liet vervolgens zien dat in de implantaten zonder rhTGF-β1 bijna geen bot was gevormd. Daarentegen werd wel bot gevormd in de porositeit van de PPF-TGF-β1 implantaten. Het nieuw gevormde bot had een trabeculaire structuur . Tussen de trabekels werd beenmergachtig weefsel gezien. Echter de botvorming in de PPF-TGF-β1 implantaten vertoonde grote interindividuele verschillen. De hoeveelheid botvorming varieerde van vrijwel volledige opvulling van de PPF-porositeit tot een zeer beperkte opvulling. Deze histologische bevindingen werden bevestigd door beeldanalyse, waarbij er kwantitatief telkens meer bot in de PPF-TGF-β1 implantaten werd waargenomen in vergelijking met de andere voorbehandelingen. Fluorochrome merkers lieten zien dat in de PPF-TGF-β1 -implantaten de botvorming startte in het midden van een porie en zich vervolgens uitbreidde op centrifugale wijze in de richting van het oppervlak van de PPF. In PPF-Gd-, PPF-Pw- en PPF-Fn-implantaten was zichtbaar dat beperkte bot-geleiding had plaatsgevonden vanuit de oorspronkelijke rand van het botdefect tot aan de PPF-drager. Op basis van deze bevindingen concludeerden we dat een PPF-dragermateriaal biocompatibel is met bot tijdens de experimentele periode. Daarnaast kan rhTGF-β1 op adequate wijze botvorming induceren in poreus PPF. Deze resultaten geven aan dat een PPF-drager voorzien van rhTGF-β1 zeer geschikt is voor het vervaardigen van BGSs.


Afsluitende opmerkingen en toekomstperspectief


Het onderzoek dat werd uitgevoerd in dit proefschrift, toont aan dat de combinatie van titaniumvezelgaas met osteogene cellen of osteo-inductieve groeifactoren zoals BMP en TGF-β, gebruikt kan worden ter vervaardiging van bottransplantaten. Dit werd geïllustreerd door de ostegene expressie in vitro en de vorming van botachtig weefsel in vivo. In vitro vonden we dat het verhogen van de celdichtheid en de rhBMP-2 concentratie een positieve invloed had op de osteogene expressie. Het in vivo gebruik van tissue engineering strategieën waarbij cellen gebruikt worden voor het vervaardigen van BGSs, resulteerde in de vorming van een beperkte hoeveelheid nieuw bot. Daarom onderzochten we de werkzaamheid van doorkweken in vitro. Het effect van doorkweken bleek verschillend te zijn voor implantaten met en zonder Ca-P coating: alleen de eerstgenoemde groep bleek botvorming te ondersteunen. Voor de implantaten met een Ca-P coating leek de hoeveelheid nieuw bot enigszins te zijn toegenomen in vergelijking met de eerdere studie. Andere experimenten lieten daarnaast zien dat ook de combinatie van titanium vezelgaas met BMPs ectopische botvorming kan induceren. Bovendien hebben we laten zien dat de combinatie van recombinante humane BMP en (deels) gezuiverde bovine BMP hierbij synergistisch werkt.

Wanneer de resultaten van het onderzoek –waarin titanium met rhBMP-2 werd geladen–worden vergeleken met het onderzoek –waarin deze drager met cellen werd geladen–, blijkt dat in de eerstgenoemde groep niet alleen meer bot gevormd wordt maar dat de botvorming eveneens op meer reproduceerbare wijze plaatsvindt. In het botvormingsproces dat door BMP wordt geïnduceerd is altijd een kraakbeenfase aanwezig. Een vergelijkende studie tussen titanium vezelgaas en andere dragers, twee waarvan eerder werd gevonden dat zij enchondrale botvorming induceerden (FGM, IBM) en één waarvan eerder was gevonden dat het directe botvorming induceerde (PPHAP), liet zien dat toch voor alle dragers een kraakbeenfase aanwezig was. Bovendien suggereren deze bevindingen dat bij rhBMP-2-geïnduceerde botvorming altijd een enchondrale botvormingachtig proces plaatsvindt ongeacht het gebruikte dragermateriaal. De hoeveelheid kraakbeen kan hierbij echter verschillen. Wij veronderstellen dat deze verschillen samenhangen met de mate waarin het dragermateriaal de ingroei van bloedvaten stimuleert. In dragers die vaatingroei stimuleren vindt vroege osteogenese plaats en verdwijnt het gevormde kraakbeen eerder. In dragers die de vaatingroei remmen wordt een grotere hoeveelheid kraakbeen gevormd die ook langer aanwezig blijft. Daarom zouden op deze twee groepen respectievelijk de termen “bone directing” en “cartilage directing” van toepassing kunnen zijn. Deze informatie in combinatie met de toenemende kennis op het gebied van het afgiftepatroon van groei-factoren van verschillende dragers, zou een meer rationele benadering van het ontwikkelen van dragers mogelijk maken. Deze benadering is eveneens van belang bij de uiteindelijke klinische toepassing, waarbij een drager die bot induceert van een hoge kwaliteit binnen een korte tijdsperiode zeer wenselijk is.

Verder onderzoek liet zien dat titanium vezelgaas voorzien van rhTGF-β1 eveneens de genezing van botdefecten kan stimuleren. Ons onderzoek van titanium vezelgaas zonder rhTGF-β1 liet zien dat titanium vezelgaas zelf al over goede osteoconductieve eigenschappen bezit. In aanvulling op het gebruik van het titanium vezelgaas ter vervaardiging van BGSs zijn deze resultaten veelbelovend voor de toepassing (met of zonder groeifactoren) van dit materiaal bij de fixatie van implantaten. Aanvullende experimenten met een nieuw ontwikkelde polymeer, poreus poly(propyleen fumaraat) (PPF) drager toonde aan dat dit materiaal biocompatibel was met bot en botvorming kon induceren wanneer het was voorzien van rhTGF-β1 . Echter wanneer dit materiaal werd voorzien van dezelfde hoeveelheid rhTGF-β1 als de titanium drager resulteerde dit in minder botvorming waarbij ook nog eens een grotere variatie tussen de implantaten aanwezig was. Dit is mogelijk gerelateerd aan een lagere rhTGF- β1 retentie in de PPF. Daarom is de keuze van een passend dragermateriaal afhankelijk van de uiteindelijke toepassing: afbreekbaarheid kan immers wenselijk zijn in bepaalde situaties, terwijl mechanische en structurele eigenschappen vereist zijn in andere situaties.

Ondanks het gunstige effect van TGF-β op botgenezing moet worden benadrukt dat enige bezorgdheid bestaat omtrent de veiligheid van deze groeifactor bij toediening aan mensen. Echter tot op heden is geen causaal verband aangetoond tussen lokale toediening van lage doses TGF-β en nadelige effecten op de nier of lever. Niettemin is het belangrijk dat een therapeutische index wordt bepaald voor TGF-β die een meer rationele benadering mogelijk maakt voor de veilige afgifte en dosering van deze groeifactor in lokale therapeutische toepassingen.

De toepassing van een dunne Ca-P coating op titanium vezelgaas heeft aangetoond dat dit de botvorming verder stimuleert, zowel voor dragers met osteogene cellen als dragers met BMP-2. Echter de gebruikte hoog vacuüm coating techniek zou wel eens niet de meest optimale kunnen zijn voor deze toepassing, omdat wij weten dat de coating niet door het hele materiaal heen dringt en het bioactieve oppervlak derhalve niet aanwezig is door het gehele dragermateriaal. Dit werd geïllustreerd door de wijze waarop de botvorming plaatsvond in de dragers met een Ca-P coating. Tevens blijkt deze beperking van de gebruikte coating techniek uit het feit dat de osteoconductieve eigenschappen van titanium vezelgaas niet gestimuleerd werden.

Gelet op het voorgaande dient toekomstig onderzoek te zijn gericht op een aanpak die voorziet in het ontwikkelen van een gestandaardiseerde en reproduceerbare oppervlakte voorbehandelingstechniek, die de functionaliteit van een dragermateriaal kan verbeteren. Mogelijkheden zijn wellicht het gebruik van sol-gel en biometische coatings.

Onze in vitro studies lieten zien dat bij het gebruik van statische kweekmethoden cellen en gemineraliseerde matrix alleen gevonden worden bovenin het vezelgaas. Om dit probleem op te lossen moet meer gebruik gemaakt worden van dynamische zaai- en kweek-methoden zoals “perfusion flow” en “rotating wall vessels” (RVWs). Andere onderzoekers hebben reeds bewezen dat deze methoden nuttig kunnen zijn bij het vervaardigen van botachtig weefsel in vitro. In onze onderzoeksgroep hebben we reeds gebruik gemaakt van een “perfusion flow” systeem. Het gebruik van dit systeem liet inderdaad een toename zien van de osteogene expressie in titanium vezelgaas in vitro. Het voordeel van dynamische methoden op de botvorming in vivo moet echter nog worden onderzocht.

Daarnaast moeten we benadrukken dat het differentiatie proces van osteoblasten slechts voor een deel is opgehelderd. Een toename van de kennis op dit gebied zou een meer gerichte benadering mogelijk maken met betrekking tot tissue engineering van botweefsel. Celselectie van osteoprogenitor cellen of mesenchymale stamcellen door specifieke celmarkers of antilichamen zou in dit verband bijvoorbeeld een oplossing kunnen bieden. Hoewel een deel van het intracellulaire communicatieproces voor BMPs via de zogenaamde Smad route en de daaropvolgende genactivatie, die resulteert in osteoblast differentiatie, momenteel is opgehelderd, is de precieze route die BMPs gebruiken bij de activatie van specifieke osteoblastgenen nog niet onderzocht. Vergroting van de kennis op dit terrein is essentieel voor de uiteindelijke klinische therapeutische toepassing van BMP.

De positieve resultaten die werden gevonden in knaagdieren, dienen herhaald te worden in hogere dieren alvorens een betrouwbare extrapolatie mogelijk is naar de klinische situatie. In recent klinisch onderzoek bijvoorbeeld, is de werkzaamheid van BMPs met een collageen drager aangetoond bij het genezen van botdefecten. Echter de botvormingsrespons varieert sterk tussen individuen. Ook dient te worden benadrukt dat de gebruikte doses van BMP nog steeds onfysiologisch hoog zijn en dat de lange termijn effecten en veiligheid nog moeten worden afgewacht. Reden waarom de combinatie van cellen met groeifactoren of de combinatie van verschillende groeifactoren in de juiste verhouding veelbelovend voor de toekomst is. Dit zou een afname in de gebruikte concentratie van de groeifactor mogelijk maken en de biologische activiteit wellicht vergroten.

Een andere oplossing voor het “concentratie” probleem van groeifactoren is misschien gelegen in de toepassing van een gentherapeutische benadering. In deze benadering worden cellen, uit de osteoblasten reeks of daarbuiten, genetisch getransfecteerd in vivo of in vitro. Hierbij wordt gebruik gemaakt van verschillende vectoren zoals retro-virussen om groei-factoren tot (over)expressie te brengen. De veiligheid van deze methoden en de uiteindelijke afloop van de getransfecteerde cellen dient nader te worden onderzocht.

Tot slot is het ultieme doel voor grote reconstructieve chirurgische ingrepen het creëren van een gevasculariseerde BGS door gebruik te maken van préfabricage technieken. Hierbij wordt de aanwezigheid van een vaatvoorziening gecombineerd met een osteo-inductieve drager (door de drager bijvoorbeeld in een spierlap te plaatsen), zodat op deze wijze een voorgevormd gevasculariseerd bottransplantaat kan worden vervaardigd. Andere onderzoekers hebben bij varkens (minipigs) reeds aangetoond dat wanneer keramische dragermaterialen voorzien van BMPs, in een spierlap worden geplaatst, dit resulteert in de vorming van een gevasculariseerd botransplantaat. Met deze transplantaten kunnen defecten in de mandibula worden genezen. Opnieuw dient de effectiviteit van préfabricage technieken in combinatie met dragers voorzien van botvormende cellen nog te worden bewezen in hogere diersoorten en mensen.


Summary, address to the aims, closing remarks and future perspectives


 As a means to overcome the current clinical problems associated with the regeneration of bone defects, so-called tissue engineering techniques have been developed to create bone graft substitutes (BGSs). The current experimental approach consists of the use of a mostly synthetic porous scaffold or carrier to which osteogenic cells and/or growth factors are added. While extensive research has focussed on the ideal scaffold or carrier material, none of the carrier or scaffold materials that have been used so far meet all of the required demands with respect to clinical application. In view of this, we propose the use of titanium (Ti) fiber mesh as a candidate scaffold or carrier material. Titanium fiber mesh is biocompatible, easy to use during surgery and has excellent mechanical characteristics. An additional advantage is that the titanium mesh can be provided with a thin bioactive calcium phosphate (Ca-P) coating. Therefore, in this thesis, all of the investigations revolve around the potential use of titanium fiber mesh with or without a Ca-P coating as a carrier or scaffold material in the creation of BGSs. Consequently, a general introduction to the current knowledge on bone formation and the use of tissue engineering strategies is presented in Chapter 1. In the subsequent chapters, the aims as described in the scope of the thesis are addressed in a step-wise manner. Each subsequent chapter comprises a separate investigation.


Aims


1. What is the osteogenic expression in porous titanium fiber mesh loaded with rat bone marrow cells in vitro, and how is it influenced by cell seeding density and rhBMP-2 concentration?

In chapter 2 titanium fiber mesh discs were seeded with two densities of cultured rat bone marrow (RBM) cells, i. e. a low density [3.54 x 104 cells/cm2 = 10,000 cells per mesh] and a high density [3.54 x 105 cells/cm2 = 100,000 cells per mesh]. Cells were cultured for up to sixteen days, seven days of which the cells were in the presence of various concentrations of recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2) (0, 10, 100, and 1,000 ng/ml) in order to evaluate osteogenic expression. Scanning electron microscopy (SEM), light microscopy (LM), energy dispersive spectroscopy (EDS), DNA and calcium (Ca) content measurements, and X-ray diffraction (XRD) analysis were performed. SEM and EDS evaluation showed that a confluent layer of cells was present on top of the meshes together with collagen bundles and calcified globular accretions. Light microscopical evaluation showed a densely stained layer in the upper part of the mesh. SEM and Ca content measurement showed that calcification starts at eight days. In addition, it was demonstrated that DNA content peaked at eight days. LM, SEM, and Ca content evaluation revealed positive effects of increasing the cell seeding density, the rhBMP-2 concentration and the culture time on mineralization. Increasing the cell seeding density also resulted in a positive effect on DNA content. No effects of rhBMP-2 concentration were seen on DNA content. Finally, XRD revealed that the deposited matrix contained a precipitate of a stable calcium phosphate phase. Therefore, we concluded that titanium fiber mesh sustains excellent osteogenic expression in vitro, increasing the cell seeding density has a positive effect on osteogenic expression in titanium mesh in vitro, and in high density specimens, rhBMP-2 concentrations of 100 ng/ml and 1,000 ng/ml, stimulate extracellular matrix calcification in a dose-responsive manner.

2. What is the efficacy of a titanium fiber mesh loaded with cultured osteogenic cells on bone formation in an ectopic location, and what is the additional influence of the application of a thin Ca-P coating?

Chapter 3 describes the investigation on the osteogenic activity of porous titanium fiber mesh and Ca-P-coated titanium fiber mesh loaded with cultured syngeneic osteogenic cells in a syngeneic rat ectopic assay model. In thirty syngeneic rats, Ca-P-coated and noncoated porous titanium implants were subcutaneously placed either without or loaded with cultured RBM cells. The rats were sacrificed at two, four, and eight weeks post-operative, and the implants were retrieved. Further, in the eight-week-group fluorochrome bone markers were injected at two, four, and six weeks. Histological analysis demonstrated that none of the Ca-P-coated and non-coated meshes alone supported bone formation at any time period. In RBM-loaded implants, bone formation started at two weeks. At four weeks, bone formation increased. However, at eight weeks bone formation was absent in the noncoated titanium implants, while it had remained in the Ca-P-coated titanium implants. Also, in Ca-P-coated implants more bone was formed than in non-coated samples. In general, osteogenesis was characterized by the occurrence of multiple spheres in the porosity of the mesh. The accumulation sequence of the fluorochrome markers showed that the newly formed bone was deposited in a centrifugal manner starting at the center of a pore. On the basis of our results, we concluded that the combination of Ti-mesh with rat bone marrow cells can indeed generate bone formation. In addition, a thin Ca-P coating can have a beneficial effect on the bone-generating properties of a scaffold material. Nevertheless, the occurrence as well as the amount of new bone were very limited using the procedures described in this study.

3. What is the effect of the cell seeding method in combination with prolonged in situ culturing on bone formation in titanium fiber mesh scaffolds in an ectopic location?

In the investigation described in chapter 3 we found that the occurrence as well as the amount of bone formation were very limited when osteogenic cells were seeded in Ti-fiber mesh scaffolds. We assumed that this was related to our culture and cell-loading technique that consisted of the use of the so-called droplet loading technique without prolonged culturing in vitro. Therefore, in the experiment described in chapter 4 we examined the osteogenic activity of Ca-P-coated and non-coated porous Ti-fiber mesh loaded with cultured syngeneic osteogenic cells after prolonged in situ culturing in a syngeneic rat ectopic assay model. RBM cells were loaded onto the CaP-coated and non-coated Ti-scaffolds using either a droplet or a suspension loading method. After loading, the RBM cells were cultured for eight days in vitro. Thereafter, implants were subcutaneously placed in thirty-nine syngeneic rats. The rats were sacrificed and the implants retrieved at two, four, and eight weeks post-operatively. Further, in the eight-week-group fluorochrome bone markers were injected at two, four, and six weeks. Histological analysis demonstrated that only the Ca-P coated meshes supported bone formation. The amount of newly formed bone varied between single or multiple spheres to filling a significant part of the mesh porosity. In the newly formed bone, osteocytes embedded in a mineralized matrix could clearly be observed. On the other hand, in the non-coated Ti-implants abundant mineralization was present without a bone-like tissue organization. Calcium content analysis revealed that the cell-loading method did not influence the final amount of bone formation. In Ca-P-coated implants the accumulation sequence of the fluorochrome markers showed bonding osteogenesis. We conclude that the combination of Ti-mesh with RBM cells can indeed generate ectopic bone formation after prolonged in vitro culturing. The effect of prolonged culturing in vitro was different for the Ti-CaP and Ti implants: only Ca-P-coated implants supported bone formation. No effect of the loading method was observed on the final amount of bone. Finally, our results confirmed once again that a thin Ca-P coating can have an additional positive effect on the bone-generating properties of a scaffold material.

4. Can titanium fiber mesh loaded with Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) induce bone formation in an ectopic location, and can the osteoinductive effect of recombinant human BMP synergistically be enhanced by native bovine BMPs?

In chapter 5 we evaluated the osteoinductive properties of porous Ti-fiber mesh with or without a calcium phosphate (Ca-P)-coating and loaded with rhBMP-2 or rhBMP-2 and native bovine BMP [S-300 BMP cocktail (S-300)] in a rat ectopic assay model. One hundred and twelve Ca-P-coated and one hundred and twelve non-coated porous Ti-implants, either loaded with rhBMP-2 and S-300 or loaded with rhBMP-2 alone, were subcutaneously placed in fifty-six Wistar King rats. The rats were sacrificed at five, ten, twenty, and forty days post-operative and the implants retrieved. Histological analysis demonstrated that all growth factor and carrier combinations had induced ectopic cartilage and then bone formation at five and ten days, respectively. At twenty days, bone formation increased and was characterized by trabecular bone and bone marrow-like tissue. At forty days, more lamellar bone and hemopoietic bone marrow-like tissue were present. At both times more bone had been formed in the Ca-P-coated implants than in the non-coated samples. In addition, bone formation was higher in the rhBMP-2 and S-300-loaded specimens than in the rhBMP-2-only-loaded specimens. In rhBMP-2-only-loaded specimens bone formation

was mainly localized inside the mesh material, while in specimens loaded with both rhBMP-2 and S-300 the bone was localized inside as well as surrounding the Ti-mesh. The histological findings were confirmed by calcium content and alkaline phosphatase activity measurements. In addition, all specimens showed osteocalcin expression as early as five days. From these findings we deduced that the combination of Ti-mesh with BMPs can indeed induce ectopic bone formation and that this bone formation seems to be similar to “enchondral” ossification, a thin Ca-P coating can have a beneficial effect on the bone-inducing properties of a scaffold material, and rhBMP-2 and native BMP act synergistically in ectopic bone induction.

5. What is the nature of the bone induction process in various BMP-loaded carrier materials?

In chapter 6 we studied the osteoinductive properties of porous Ti-fiber mesh with a calcium phosphate (Ca-P)-coating (Ti-CaP), insoluble bone matrix (IBM), fibrous glass membrane (FGM) and porous particles of hydroxyapatite (PPHAP), all loaded with rhBMP-2, using a rat ectopic assay model and short implantation periods. Twelve Ti-CaP, twelve IBM, twelve FGM and twelve PPHAP implants, all loaded with rhBMP-2 were subcutaneously placed in sixteen Wistar King rats. The rats were sacrificed at three, five, seven, and nine days post-operative, and the implants were retrieved. Histological analysis demonstrated that both IBM and Ti-CaP had induced ectopic cartilage and bone formation by five and seven days, respectively, while in PPHAP bone and cartilage formation were seen concurrently at seven days. At nine days, cartilage was seen together with trabecular bone in Ti-CaP, IBM, and PPHAP, while in FGM only cartilage was observed. We concluded that IBM, Ti-CaP, FGM, and PPHAP, when loaded with rhBMP-2, can indeed induce ectopic bone formation with a cartilaginous phase in a rat model at short implantation periods. Given the different nature of the carrier materials used these findings even suggest that an endochondral ossification-like process is always present in rhBMP-2 induced osteogenesis, even though the amount of cartilage may differ. We believe these differences are related to the vascular-inducing geometry.

6. What is the bone formation-supporting efficacy of titanium fiber mesh as-received, provided with a thin calcium phosphate coating, or loaded with rhTGF- b1 in an orthotopic site?

In Chapter 7 we evaluated the bone formation-supporting properties of porous titanium (Ti) fiber mesh with or without a calcium phosphate (Ca-P)-coating or loaded with recombinant human Transforming Growth Factor beta-1 (rhTGF-b1) in a rabbit noncritical size cranial defect model. Nine Ca-P-coated and eighteen non-coated porous titanium implants, half of the latter loaded with rhTGF-b1, were bilaterally placed in the cranium of eighteen New Zealand white rabbits. At eight weeks post-operative, the rabbits were euthanized and the skulls with the implants retrieved. Histological analysis demonstrated that in the TGF-b1-loaded implants bone had been formed throughout the implant up to its center, whereas in the non-loaded implants only partial ingrowth of bone was observed. Bone formation had a trabecular appearance together with bone marrow-like tissue. No difference in ingrowth could be observed between the non-TGF-b1-loaded, non-coated implants and the CaP-coated ones. All histological findings were confirmed by image analysis: 97% ingrowth was observed in the rhTGF-b1-loaded implants, while only 57% and 54% ingrowth was observed in the non-loaded Ca-P-coated and non-coated implants, respectively. Bone surface area and bone fill were significantly higher in the rhTGF-b1-loaded implants

(1.37 mm2 and 36%, respectively) than in the non-loaded implants (0.57 mm2 and 26%). No statistical difference was found for any parameter between the CaP-coated and non-coated implants. Quadruple fluorochrome labeling showed that in the Ti and Ti-CaP implants mainly bone guidance had occurred from the former defect edge, while in the Ti-TGF-b1 implants bone formation had mainly started in the center of a pore and proceeded in a centrifugal manner. Based on these observations we concluded that the combination of Ti-mesh with TGF-b1 can induce orthotopic bone formation, that Ti-fiber mesh has good osteoconductive properties, and that a thin Ca-P coating, as applied in this study, does not seem to further enhance the bone-conducting properties of a Ti-scaffold material.

7. What is the efficacy of porous PPF provided with rhTGF- b1 on bone induction in an orthotopic site, and what is the effect of a fibronectin coating on the bone response to porous PPF?

In Chapter 8 we determined bone growth into pretreated poly(propylene fumarate) (PPF) scaffolds implanted into a sub-critical size, rabbit cranial defect. PPF scaffolds were first constructed using a photo-crosslinking/porogen leaching technique. These scaffolds were then either prewetted (PPF-Pw), treated with radio frequent (RF) glow-discharge (PPF-Gd), coated with fibronectin (PPF-Fn), or coated with rhTGF-b1 (PPF-TGF-b1). One of each scaffold type was subsequently placed into the cranium of nine New Zealand white rabbits. The rabbits were euthanized after eight weeks and the scaffolds were retrieved for histological analysis. Little or no bone formation was observed in implants without rhTGF-b1 or in those with a fibronectin coating. No differences in bone formation were observed between the PPF scaffolds without rhTGF-b1. The most bone formation was present in the PPF-TGF-b1 implants; the newly formed bone had a trabecular appearance together with bone marrow-like tissue. However, bone formation showed a high inter-implant variation, from filling almost the entire porosity up to some bone formation because of the variable TGF-b1 retention on the implants. These histological findings were confirmed by image analysis. Bone surface area, bone area percentage, pore fill percentage, and pore area percentage were significantly higher in the rhTGF-b1-coated implants than in the non-coated implants. No statistical difference was seen between the PPF-Fn, PPF-Pw, or PPF-Gd scaffolds for these parameters. Quadruple fluorochrome labelling showed that in PPF-TGF-b1 implants bone formation mainly started in the interior of a pore and proceeded towards the scaffold. In PPF-Gd, PPF-Pw and PPF-Fn implants, limited bone guidance had occurred from the former defect edge up to the PPF scaffold. We concluded that a PPF scaffold is bone biocompatible and, in the configuration utilized, shows minimal signs of degradation during the experimental period. TGF-b1 can indeed adequately induce bone formation in porous PPF. These results indicate that PPF-TGF-b1 scaffolds prepared by the photo-crosslinking/porogen leaching technique are good candidates for the creation of bone graft substitutes.


Closing remarks and future perspectives


The research conducted in this thesis provides evidence that the combination of Ti-mesh with osteogenic cells or osteoinductive factors like BMP and TGF-b can be used in the creation of bone graft substitutes.

This was demonstrated by the osteogenic expression in vitro and the deposition of bone-like tissue in vivo. In vitro we found that increasing the cell seeding density and rhBMP-2 concentration enhanced osteogenic expression. On the other hand, in vivo use of cell-based strategies in the creation of BGS, resulted in a limited amount of newly formed bone. Therefore, we investigated the efficacy of prolonged culturing in vitro. This effect appeared to be different for the Ca-P-coated and non-coated implants in which only the Ca-P-coated implants supported bone formation. Also, for these implants the amount of bone seemed to be slightly enhanced compared with the earlier study. Further experiments showed that the combination of Ti-mesh with BMPs can also effectively induce bone formation in ectopic locations. In addition, we showed that the combination of recombinant and partially purified native BMP act synergistically in ectopic bone induction. A comparison of the results of rhBMP-2 loaded and cell-loaded scaffolds, revealed that the rhBMP-2-loaded carrier yielded not only a greater quantity but also more reproducible bone formation in the rat ectopic assay model. The BMP-induced bone formation process also occurred with a cartilaginous phase present and therefore seemed similar to “enchondral” ossification. In addition, a comparative study between Ti-fiber mesh and various other carriers, some of which are known from previous studies to form bone through an endochondral ossification-like process (FGM, IBM) and one of which is known to induce direct ossification (PPHAP), showed the presence of a cartilaginous phase for all carriers. Considering the different nature of the carrier materials used, these findings even suggest that an endochondral ossification-like process is always present in rhBMP-2-induced osteogenesis, although the amount of cartilage does differ. The difference is believed to be related to the vascular-inducing geometry of the carriers. Carriers which show a higher vascularinducing geometry lead to early osteogenesis and a early disappearance of cartilage, while a vascular-inhibiting geometry will lead to greater amounts of cartilage that remain for a longer time. Therefore, the terms “bone-directing” and “cartilage-directing” carrier might be appropriate for the former and the latter, respectively. This information, together with an increasing knowledge of the growth factor release profiles from different carriers, should allow a more rational approach towards carrier design and will also be beneficial in the final clinical application, where a carrier that yields high-quality bone within a short time period is highly desirable.

Further investigations showed that Ti-mesh loaded with TGF-b can stimulate bone defect healing. Our investigation of non-TGF-b-loaded titanium scaffolds revealed that the titanium fiber mesh itself has good osteoconductive properties. In addition to its application for the creation of bone graft substitutes, these investigations hold some promise for the use of titanium fiber mesh with or without growth factors in implant fixational use. Additional experiments with a newly developed porous poly(propylene fumarate) (PPF) scaffold demonstrated that this material was also bone-biocompatible and could adequately induce bone formation when loaded with rhTGF-b1. Nevertheless, when loaded with the same dose of rhTGF-b1 as the Ti-carrier, PPF yielded less bone formation with a higher interimplant variability. This was thought to be related to a lower retention of TGF-bon the PPF implants. In view of this, we have to notice that the choice of an appropriate material depends on the final application: degradation might be desirable in some situations while mechanical and structural properties are mandatory in others. Despite the favorable effect of TGF-b on bone healing, it has to be emphasized that some concern exists with respect to the safety of this growth factor in human administration. However, no causal connection between local administration of low doses of TGF-b and adverse renal and hepatic effects have been proven. Still, it is important that a therapeutic index will be established for TGF-b, thereby allowing a rational approach for the safe delivery and dosage of this growth factor in local therapeutic use.

The application of a thin calcium phosphate coating has been shown to further stimulate the bone formation process for osteogenic cell- and BMP-2-loaded scaffolds. However, the coating technique used might not be the optimal one for a porous scaffold,since it does not provide a bioactive surface throughout the scaffold. This was illustrated by the absence of bonding osteogenesis inside the CaP-coated scaffolds in cell-loaded and BMP-loaded scaffolds and the non-stimulative effect on the osteoconductive properties of the Ti-fiber mesh.

Consequently, future efforts should be directed towards approaches which provide a standardized and reproducible surface and improve the (biocompatibility and) functionality of the carrier material. Examples of such methodologies are sol-gel and biomimetic routes.

Our in vitro studies showed that the use of static culture methods resulted in the occurrence of osteogenic cells together with mineralized matrix in only the upper part of the mesh. After prolonged culturing in vitro and subsequent implantation, bone deposition was also observed in the upper mesh area. As a means of overcoming this problem, in vitro BGS culturing techniques should be directed towards dynamic seeding and culture methods like perfusion flow and rotating wall vessels (RWVs). Other investigators have proven that these methods are more beneficial in the generation of tissue-engineered bone-like tissue in vitro. In our group a perfusion system has also been used, which indeed did show an enhancement of osteogenic expression in titanium fiber mesh in vitro. Nevertheless the advantage of dynamic culture methods on in vivo bone formation remains to be investigated.

Moreover, we have to stress that the differentiation pathway of cells within the osteogenic lineage is still poorly understood. Increased knowledge in this area should enable a more rational approach towards tissue engineering of bone tissue. Cell selection that would enable the isolation of true osteo-progenitor cells or mesenchymal stem cells, for example through the development of specific cell markers or antibodies, would allow such an approach.

Although some of the intracellular signaling for BMPs through the Smad pathway, and the subsequent gene activation resulting in osteoblast differentiation, has now been elucidated the pathway used by BMPs in the activation of particular osteoblast genes remains to be investigated. Increased knowledge in this field will result in a rational basis in the development of clinical therapeutical strategies.

The favorable results that we obtained in rodents should be repeated in higher animals prior to a reliable transfer to the clinical situation. For example, in recent research, BMPs have been proven to be effective in clinical trials when used with a collagen carrier. However, the response varies strongly between individuals. It has also to be emphasized that the BMP doses used are still unphysiologically high and that long-term efficacy and safety have to be awaited. Consequently, the combination of cells and growth factors and or the combination of different growth factors in an appropriate combination holds promise for the future. It might enable a decrease in the concentration of growth factors used and enhance the biological activity.

Another solution for the “concentration” problem of growth factors can perhaps be found by using a gene therapeutical approach in which cells within or outside the osteogenic lineage are genetically transfected in vivo or in vitro by different vectors such as retroviruses in order to overexpress growth factors. The safety of these methods concerning the fate of the transfected cells still needs further investigation.

Finally, the ultimate goal for large reconstructive surgical procedures will be the creation of a vascularized BGS using prefabrication techniques in which a vascular pedicle, for example muscle flap, is combined with an osteoinductive scaffold to form a preshaped vascularized bone graft. Other researchers have proven that ceramic scaffolds loaded with BMPs placed in a muscle flap can be used to create a vascularized bone graft substitute and to regenerate a mandibular defect in minipigs. Again, the effectiveness of the combination of cell-based scaffolds and prefabrication remains to be proven in higher animals and humans.
Powered By: webCiters