Ga door naar hoofdcontent
LiteratuurJacqueline Bastiaanse – Preservation Of Muscle Microcirculation

Jacqueline Bastiaanse – Preservation Of Muscle Microcirculation

Afbeelding voor Jacqueline Bastiaanse – Preservation Of Muscle Microcirculation


In plastic surgery, complex defects are usually reconstructed with free flaps. Common indications include reconstruction after tumor ablation or trauma and reconstruction of congenital defects and chronic wounds. The survival rate of these flaps is high (95-98%). The functional outcome, however, can be suboptimal. Furthermore, donor site morbidity can be quite substantial.

The use of composite tissue allografts (CTAs) may improve the results of free tissue transfer, because of reduced functional loss and absence of donorsite morbidity. Transplantation of an organ or (composite) tissue involves an obligatory period of ischemia, followed by reperfusion; together, this can induce tissue injury (see below). Of all tissues present in CTAs, muscle is most sensitive to ischemia. Therefore, the aim of this thesis was to investigate various preservation strategies for muscle tissue in order to contribute to the development of an optimal preservation strategy for CTAs. At present, cooling is the best preservation strategy for CTAs. In previous studies, it was found that cold storage of isolated skeletal rat muscles in Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate-Bretschneider solution (HTK) solution at4°C was beneficial for preservation of contractility of these muscles. This preservation strategy was based on diffusion. In larger (human) muscles this may be not sufficient due to large diffusion distances; perfusion of the tissue with a preservation solution may be required. Moreover, preservation of the vascular bed is of major importance for tissue survival. In this thesis, we assessed the effects of hypothermia and pre-ischemic perfusion with various preservation solutions on the consequences of ischemia and reperfusion, or transplantation for the microcirculation in vivo, in rat cremaster muscle. This muscle can be isolated on its vascular pedicle and perfused with a preservation solution; in addition, it allows in vivo examination of various microcirculatory parameters with the use of intravital microscopy (Chapter 1).

As an introduction to the experimental chapters, chapter 2 of this thesis provides an overview of literature on transplantation, ischemia/ reperfusion injury, preservations solutions, and relevant methods from microcirculation research.

Transplantation of an organ or (composite) tissue involves an unavoidable period of ischemia during surgery, preservation, and revascularization. During this ischemic period, blood supply to the tissue is interrupted, which initiates a sequence of cellular and biochemical events that can lead to cellular dysfunction and ultimately to cell death. Although restoration of blood flow and oxygenation of the tissue is a prerequisite for recovery of ischemic tissue, reperfusion itself may also result in an enhancement of tissue injury. Current methods of organ and tissue preservation are based on suppression of metabolism by hypothermia and on systems that support active metabolism. To render organs tolerant to hypothermia, blood is removed and replaced with an appropriate hypothermic preservation solution. The composition of the preservative appears to be a critical determinant of tolerance of the organ to hypothermic storage. The ideal preservation solution provides metabolites, substrates, and agents that enhance recovery of the organ on reperfusion, and suppresses unwanted reactions and breakdown of critically important metabolites. The biochemical factors (and their concentrations) necessary for high-quality, long-term organ preservation are not yet fully known; further research in this field is necessary. The combination of hypothermia and an optimal preservation fluid will help to minimize injury, when a tissue is reperfused with blood at the end of the transplantation procedure (chapter 2).

In our initial studies (chapters 3 and 4), we first established the micro­vascular consequences of 4 and 6 hours of total, warm ischemia of the rat cremaster muscle, without using any preservation strategy. After 4 hours of warm ischemia, capillary perfusion of the muscle resumed at 50% and recovered to 90% of baseline levels during the 2 hours of reperfusion (chapter 3). After 6 hours of warm ischemia, no recovery occurred: capillary perfusion remained at 45% of baseline levels (chapter 4). In addition to this decrease in tissue perfusion, a period of warm ischemia also induced an inflammatory reaction: a significant increase in the level of leukocyte-vessel wall interactions was observed in the venules during reperfusion after 4 hours of ischemia (chapter 3). No such increase occurred after 6 hours of warm ischemia, possibly due to reduced venular flow and, hence, decreased leukocyte delivery during reperfusion (chapter 4).

In the study described in chapter 4 we assessed the effects of hypothermia on the microvascular consequences of 4 and 6 hours of ischemia and 2 hours of reperfusion in the rat cremaster muscle. Cooling of the tissue to 4°C during the ischemic period was clearly beneficial for the microcirculation. It completely prevented the 50% reduction in capillary perfusion after 4 hours of ischemia, while only a slight decrease (<10%) in capillary perfusion was observed after 6 hours of cold ischemia. In addition, hypothermia attenuated the significant increase in venular leukocyte-vessel wall interactions after 4 hours of ischemia. In conclusion, hypothermia preserved capillary perfusion and prevented the inflammatory reaction during reperfusion after muscle tissue ischemia (chapter 4).

In chapters 3, 4 and 5 we investigated the protective potential of pre-ischemic perfusion of the tissue with a preservation solution. In the first studies we focused on the effects of Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate-Bretschneider solution (HTK). HTK is an intracellular type preservation solution with a low viscosity. It was originally designed as a cardioplegic solution. The basic philosophy behind the development of this solution is the introduction of a very potent buffer system (histidin, along with the two substrates tryptophan and ketogutarate).

Pre-ischemic perfusion with HTK had no beneficial effect on capillary perfusion after 4 and 6 hours of warm or cold ischemia, irrespective of the temperature of the HTK solution (chapters 3 and 4). In addition, pre-ischemic perfusion with HTK at 22°C had no effects on venular leukocyte -endothelium interactions (chapter 3). In contrast, pre-ischemic perfusion with HTK at 4°C attenuated the inflammatory response after 4 hours of warm ischemia (chapter 3). In conclusion, pre-ischemic perfusion of the vasculature with HTK did not improve the beneficial effects of hypothermia on tissue perfusion, but attenuated the inflammatory response when applied at 4°C.

We also evaluated the effects of Celsior, an extracellular preservation solution specifically designed for cardiac preservation (chapter 5). Celsior combines the general principles of preservation solutions with properties specific of the heart such as prevention of the development of ischemic contracture and dysfunction due to edema. Because of the high amount of free-radical scavengers in Celsior, we hypothesized that pre-ischemic perfusion with Celsior would show more beneficial effects on the preservation of the muscular microvasculature than HTK. It turned out that -like HTK- Celsior did not improve capillary perfusion after 4 or 6 hours of warm ischemia (chapter 5). Celsior pre-treatment actually deteriorated capillary perfusion: it remained low during the entire reperfusion period after 4 hours of ischemia, and decreased even further after 6 hours of ischemia. However, Celsior eliminated the increase in leukocyte-vessel wall interactions observed after 4 or 6 hours of warm ischemia, which is similar to the effect of HTK. These data suggest that HTK is more suited as a preservation solution for muscular tissue than Celsior, especially when the known protective effects of HTK on muscle function are taken into account.

The rat cremaster model was used to simulate clinical conditions of transplantation. In case of prolonged periods of ischemia, the cremaster had to be harvested, stored in a preservation solution, and transplanted.

In the study described in chapter 6, we examined the effects of transplantation and ischemia/reperfusion on the microcirculation after prolonged cold storage in HTK (4°C). Cremaster muscle transplantations were performed immediately, or after 8 or 24 hours of cold storage in HTK or saline. After direct transplantation capillary perfusion was 90% of control. Transplantation after 8 hours of cold storage in either HTK or saline did not deteriorate capillary perfusion. When the tissue was stored for 24 hours, HTK was superior to saline in preserving capillary perfusion. After 24 hours of preservation in HTK (4°C), capillary perfusion was about 80% of control as compared to preservation in saline, which resulted in only 30% capillary reperfusion after 24 hours of cold storage. Immediate transplantation induced a small increase in leukocyte adhesion. Prolonged cold storage in either fluid resulted in reduced flow velocities (qualitative observations) and edema formation, which hampered quantification of leukocyte -endothelium interactions. In conclusion, even after 8 or 24 hours of cold storage in HTK, transplantation of rat cremaster muscle was successful with good capillary perfusion. Preservation of capillary perfusion was significantly better in HTK than in saline.

In conclusion, the best strategy to preserve the microcirculation in muscle tissue is dependent on the duration of the ischemic period. In case of short ischemic periods (few hours), hypothermia can be applied to protect the microvascular compartment from damaging effects during reperfusion; the use of a preservation solution has no additional effect. When the muscle tissue has to be stored for longer periods (24 hours), the use of the preservation solution HTK at 4°C is recommended to preserve the microcirculation, and also the function of the muscle. Considering the fact that -of all tissues present in CTAs- muscle is most vulnerable to the damaging effects of ischemia and reperfusion, cold storage in HTK may also be the method of choice in case of prolonged ischemia times before CT allografting.

The ultimate goal of organ preservation research is to provide preservation of unlimited duration. The ability to preserve tissues or organs for at least one week would make organ banks a reality. Long-term preservation will require a better understanding of the mechanisms of tissue damage caused by ischemia and reperfusion. When these mechanisms are understood, a rational approach to the therapeutic intervention can be defined and long-term organ and tissue preservation will become reality.


Complexe weefseldefecten kunnen ontstaan na traumatische verwondingen, amputatie van vingers of ledematen, of na het verwijderen van tumoren. Ook kan er sprake zijn van congenitale defecten of chronische wonden. Deze defecten worden gereconstrueerd met behulp van weefsel gelegen in de nabijheid van het defect. Indien dit niet mogelijk is, bijvoorbeeld in geval van zeer grote defecten, wordt er weefsel dat niet essentieel is voor het lichaam, getransplanteerd naar een andere plaats van het lichaam, zodat vorm en functie hersteld kunnen worden. Dit zijn zogenoemde microvasculaire transplantaten (vrije lappen of weefsel transplantaties). De aan- en afvoerende vaten van een dergelijke “vrije lap” worden met behulp van een operatie­microscoop aangesloten (geanastomoseerd) in het te reconstrueren gebied en hierna kan de bloedstroom weer hersteld worden. Tijdens het uitnemen van het weefsel en het anastomoseren van de vaten wordt het weefsel tijdelijk niet van bloed voorzien (ischemie; deze periode wordt aangeduid als ischemische periode). Het overlevingspercentage (of succespercentage) van deze vrije lappen is hoog: 95-98%. Het functionele resultaat is echter vaak suboptimaal. Ook kan er sprake zijn van aanzienlijke defecten op de plaats waar het getransplanteerde weefsel is verwijderd (donorsite).

De resultaten van de microvasculaire transplantaten of vrije lappen zouden verbeterd kunnen worden, wanneer men in de kliniek gebruik zou kunnen maken van identiek donorweefsel, de zogenaamde Composite Tissue Allografts (CTAs). Deze transplantaten kunnen bestaan uit verschillende soorten weefsels, zoals spierweefsel, bloedvaten, zenuwweefsel, huid, bot en kraakbeen. Op deze wijze zou weefsel of een lichaamsdeel vervangen kunnen worden door identiek weefsel, zoals bijvoorbeeld bij een handtransplantatie. Bovendien wordt er geen nieuw defect gecreëerd bij de patiënt. Van alle weefsels die kunnen voorkomen in CTAs is spierweefsel het meest gevoelig voor een gebrek aan zuurstof ten gevolge van ischemie. Het doel van dit proefschrift was het onderzoeken van verscheidene preservatie strategieën voor spierweefsel (methodes om weefsel te bewaren of preserveren zonder functieverlies), om zo bij te dragen aan de ontwikkeling van een optimale preservatie methode voor CTAs. Experimenteel onderzoek heeft al aangetoond, dat het transplanteren van CTAs technisch mogelijk is, indien er gebruik gemaakt wordt van de benodigde immunosuppressiva. Handtransplantaties zijn reeds klinisch uitgevoerd en recent is ook een eerste (partiële) gezichtstransplantatie uitgevoerd.

Op dit moment bestaat er geen betere methode voor weefsel preservatie dan (oppervlakte) koeling: uitgenomen of geïsoleerde organen en weefsels worden gekoeld (4-15°C) in de periode tot transplantatie. In eerdere studies werd aangetoond, dat de functie (contractiliteit) van geïsoleerde rattenspieren het best bewaard bleef in Histidine-Tryptophaan-Ketoglutaraat-Bretschneider vloeistof (HTK) bij een temperatuur van 4°C. Deze bewaarmethode was gebaseerd op diffusie; de gedachte hierbij is, dat de werkzame stoffen in HTK via diffusie alle cellen in de spier bereiken. In grotere (humane) spieren is dit waarschijnlijk niet voldoende, aangezien de diffusie afstanden groot zijn. Mogelijk is dan perfusie van het weefsel met een preservatie vloeistof noodzakelijk, waardoor alle cellen in het weefsel in contact kunnen komen met bestanddelen uit de vloeistof. Behalve het spierweefsel zelf dient ook het vaatbed gepreserveerd te worden om de overleving van het weefsel te garanderen. In de studies beschreven in dit proefschrift zijn de effecten van hypothermie (koeling) en verschillende preservatie vloeistoffen op de microcirculatoire consequenties na ischemie/reperfusie of transplantatie van spierweefsel onderzocht. De studies werden in vivo uitgevoerd met behulp van intravitaal microscopie in een cremaster spier model in de rat. Deze spier kan geïsoleerd worden met behoud van de vaat-en zenuwvoorziening. Hierdoor kan een ischemische periode geïnduceerd worden en bovendien kan de spier geperfundeerd worden met verschillende preservatie vloeistoffen. Met behulp van dit model kunnen verschillende parameters in de microcirculatie onderzocht worden (hoofdstuk 1).

Als introductie op de experimentele hoofdstukken wordt in hoofdstuk 2 een overzicht van de literatuur gegeven op het gebied van transplantatie, ischemie/reperfusie, preservatie vloeistoffen en methoden voor micro­circulatie onderzoek.

Bij transplantatie van organen en weefsels is er altijd sprake van een ischemische periode, waarin het weefsel (of orgaan) niet wordt voorzien van bloed. Hierdoor worden biochemische (en cellulaire) processen geïnduceerd die kunnen leiden tot celdysfunctie of zelfs celdood. Het herstel van de bloedstroom na een ischemische periode (reperfusie) is essentieel voor de overleving van weefsel. Toch kan de reperfusie zelf ook tot extra weefselschade leiden, resulterend in verminderde functie en overleving van het weefsel. Hierbij spelen witte bloedcellen (leukocyten) een belangrijke rol. Bij de start van de reperfusie-fase treedt een cascade aan reacties op. Leukocyten worden geactiveerd en er is sprake van een toename van leukocyt-vaatwand interacties; de leukocyten die normaal gesproken vrij in de bloedstroom voorkomen, rollen langs de vaatwand en vertonen adhesie. Vervolgens verplaatsen ze zich door de vaatwand naar het weefsel. Hierdoor onstaat lekkage van vaatwanden en oedeemvorming, hetgeen leidt tot verminderde capillaire perfusie (“no-reflow”), terwijl de leukocyten bovendien direct schade kunnen toebrengen aan het weefsel. Op dit moment is koeling (hypothermie) de belangrijkste methode voor het preserveren van organen en weefsels. Bloed wordt uit organen en weefsels gespoeld en wordt vervangen door een preservatie vloeistof. De samenstelling van preservatievloeistoffen is van cruciaal belang voor orgaanpreservatie tijdens koeling. Het is op dit moment nog niet bekend wat de samenstelling van de ideale preservatievloeistof zou moeten zijn. De combinatie van hypothermie en een optimale preservatievloeistof zal de reperfusieschade, die optreedt aan het einde van de transplantatieprocedure, (wanneer het weefsel weer van bloed wordt voorzien), verminderen (hoofdstuk 2).

In onze studies beschreven in hoofdstuk 3 en 4 werden allereerst de effecten een ischemische periode (4 en 6 uur) zonder preservatiestrategie op de microcirculatie in de cremaster spier van de rat onderzocht. Na 4 uur warme ischemie hervatte de capillaire perfusie op 50% van het uitgangsniveau en herstelde vervolgens tot 90% van dit niveau gedurende de 2 uur durende reperfsusie fase (hoofdstuk 3). Na 6 uur warme ischemie trad geen herstel van de weefselperfusie op: de capillaire perfusie was 45% van het uitgangsniveau en bleef gedurende de gehele reperfusie periode op dit lage niveau (hoofdstuk 4). Warme ischemie induceerde niet alleen een vermindering van capillaire perfusie, maar ook een ontstekingsreactie. Na 4 uur warme ischemie werd gedurende de reperfusie fase een significante toename van het aantal leukocyt-vaatwandinteracties waargenomen in de venulen (hoofdstuk 3). Deze toename werd niet waargenomen na 6 uur warme ischemie, wat mogelijk te verklaren is door de verminderde doorbloeding in het weefsel (hoofdstuk 4).

In hoofdstuk 4 werden de effecten van hypothermie (koeling) op de microvasculaire gevolgen van 4 en 6 uur ischemie en 2 uur reperfusie onderzocht in de cremasterspier van de rat. Na 4 uur koude (4°C) ischemie werd er geen reductie in capillaire perfusie waargenomen; het aantal geperfundeerde capillairen was gelijk aan de controle situatie zonder ischemie. Na 6 uur koude ischemie werd slechts een geringe reductie (<10%) van het aantal geperfundeerde capillairen waargenomen. Bovendien werd door de hypothermie de ontstekingsreactie tijdens de reperfusiefase na 4 uur ischemie onderdrukt. Deze data tonen aan, dat koeling van spierweefsel gedurende de ischemische periode zowel de capillaire perfusie in stand houdt als een ontstekingsreactie voorkomt.

In de studies beschreven in hoofdstuk 3, 4 en 5 zijn de effecten van pre-ischemische perfusie van het spierweefsel met een preservatievloeistof onderzocht. In de eerste studie (hoofdstukken 3 en 4) werd de aandacht gericht op de effecten van Histidine-Tryptophaan-Ketoglutaraat-Bretschneider vloeistof (HTK) op de microcirculatie na een ischemische periode van 4 en 6 uur. HTK is een preservatie vloeistof met een lage viscositeit, die oorspronkelijk als een cardioplegie vloeistof werd gebruikt. HTK bevat een sterk buffersysteem (histidine met de substraten tryptophaan en ketoglutaraat).

Het effect van pre-ischemische HTK perfusie op leukocyt-vaatwand interacties tijdens de reperfusie was afhankelijk van de HTK temperatuur. HTK van van 22°C had geen effect, terwijl HTK van 4°C de ontstekingsreactie na 4 uur warme ischemie significant verminderde (hoofdstuk 3). Perfusie met HTK (4 of 22°C) voorafgaand aan de ischemische periode had geen effect op de capillaire perfusie (hoofdstuk 3).

Concluderend, pre-ischemische perfusie met HTK leidde niet tot verbetering van capillaire perfusie, maar onderdrukt wel de ontstekings­reactie mits gekoelde HTK wordt gebruikt.

Daarna werden ook de effecten van de preservatie vloeisof Celsior onderzocht (hoofdstuk 5). Aangezien de concentratie anti-oxidanten in Celsior hoger is dan in HTK, verwachtten we meer gunstige effecten op preservatie van de microcirculatie in spierweefsel met deze vloeistof. Pre-ischemische perfusie met Celsior leidde echter niet tot een verbetering van de capillaire perfusie na 4 of 6 uur ischemie. Integendeel, Celsior perfusie induceerde zelfs een verslechtering van de capillaire perfusie na de ischemische periode: de perfusie bleef laag tijdens de gehele reperfusie periode na 4 uur ischemie en verslechterde verder na 6 uur ischemie. Net als HTK had perfusie met Celsior wel een gunstig effect op de ontstekingsreactie na warme ischemie. Op grond van deze data lijkt HTK beter geschikt als preservatievloeistof voor spierweefsel dan Celsior, vooral wanneer het gunstige effect van HTK op de spierfunctie in overweging wordt meegenomen.

De cremasterspier van de rat werd in onze studies gebruikt als een model om de klinische transplantaties te simuleren. In geval van lange ischemie perioden (langer dan 6 uur), moet de spier echter daadwerkelijk uitgenomen, bewaard en getransplanteerd worden.

In de studie beschreven in hoofdstuk 6 werden de effecten van transplantatie en ischemie/reperfusie op de microcirculatie na langdurige preservatie in HTK (4°C) onderzocht. Cremaster spier transplantaties werden direct (zonder preservatie) uitgevoerd of na 8 of 24 uur preservatie in koude (4°C) HTK of fysiologisch zout. Na directe transplantatie was de capillaire perfusie 90% van het controle niveau. Preservatie gedurende 8 uur in koude HTK of fysiologisch zout leidde niet tot een verminderde capillaire perfusie. Na 24 uur preservatie in HTK (4°C) was het aantal geperfundeerde capillairen nog steeds 80% van de controle waarden, terwijl dit niveau daalde tot 30% als de spieren 24 uur in fysiologisch zout bewaard werden. Als het weefsel echter 24 uur bewaard werd bij een temperatuur van 4°C, was het aantal geperfundeerde capillairen hoger wanneer HTK als preservatie vloeistof werd gebruikt. Directe transplantatie leidde tot een geringe toename van leukocyt adhesie. Preservatie (gedurende 24 uur) in beide vloeistoffen leidde tot lagere bloedstroomsnelheden en oedeemvorming waardoor het meten van leukocyt-vaatwand interacties moeilijk en in veel gevallen onmogelijk was. Cremaster spier transplantaties waren succesvol en zelfs na preservatie gedurende 8 of 24 uur in koude HTK was er sprake van een goede capillaire perfusie.

Het veelvuldig gebruik van CTAs in de kliniek kan realiteit worden als het mogelijk is organen en weefsels gedurende een lange tijd te preserveren. Hiervoor is het noodzakelijk te weten welke mechanismen weefselschade veroorzaken, zodat een preservatie strategie ontwikkeld kan worden, waarmee genoemde weefselschade verminderd of voorkomen kan worden. Met het cremaster spier model (geïsoleerd op de vaatsteel) kan een transplantatie van een (humane) vrije lap nagebootst worden. Met behulp van dit model is het mogelijk om verschillende microvasculaire effecten van preservatie vloeistoffen en hypothermie bij ischemie/ reperfusie en transplantatie te onderzoeken.

Uit ons onderzoek kan geconcludeerd worden, dat de beste strategie om de microcirculatie in spierweefsel te preserveren afhangt van de duur van de ischemische periode. In geval van korte ischemie tijden (enkele uren) kan koeling voldoende protectie bieden tegen schadelijke effecten van reperfusie na transplantatie. Als er sprake is van langere ischemie tijd (24 uur) wordt het gebruik van koude HTK als preservatievloeistof aangeraden, om de microcirculatie te preseveren en ook de functie van het weefsel in stand te houden. Aangezien spierweefsel -van alle weefsels die voorkomen in CTAs-het meest gevoelig is voor de schadelijke effecten van ischemie en reperfusie, zou preservatie in koude HTK ook aangeraden kunnen worden voor CTAs preservatie wanneer sprake is van een lange ischemieduur.

Verder onderzoek naar effecten van preservatie vloeistoffen op de microcirculatie en de functie van grotere (humane) spieren na langere ischemische perioden kan in de toekomst mogelijk leiden tot frequenter toepassen van CTAs in de kliniek.